Mutaties in het leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gen zijn de meest voorkomende oorzaak van de familiale vormen van de ziekte van Parkinson (PD). De klinische en neuropathologische manifestaties van PD veroorzaakt door LRRK2 mutaties zijn meestal niet te onderscheiden van deze van sporadische vormen van de ziekte. Daarom is het inzicht in de functie van LRRK2 zeer waardevol in de studie van de moleculaire pathogenese van PD.
Het LRRK2 gen codeert voor een complex ROCO eiwit dat verschillende proteïne-interactiemotieven bevat alsook een kalatytische regio bestaande uit twee enzymatisch actieve domeinen nl. een Ras of Complex proteins (ROC) GTPase domein en een kinase domein, verbonden via een C-terminal of ROC (COR) domein. In dit eindwerk werd de functionele link tussen de intra- en inter-moleculaire organisatie van LRRK2 en zijn GTPase activiteit bestudeerd. De resulterende data bieden een mechanistisch inzicht in de werking van de Y1699C pathogene LRRK2 mutant: de Y1699C substitutie, gelegen op het intra-moleculair ROC:COR contactoppervlak, versterkt de intramoleculaire ROC:COR interactie wat resulteert in een lokale verzwakking van de dimeerstructuur van LRRK2 ter hoogte van de ROC-COR tandem met als gevolg een reductie van de GTPase activiteit. Op basis van deze resultaten kan allostere regulatie van de intra-moleculaire ROC:COR interactie naar voor geschoven worden als een zeer specifiek doelwit voor de regulatie van de enzymatische activiteit van LRRK2 en bijgevolg als een nieuwe benadering voor de behandeling van LRRK2 PD.
Globaal genomen worden er drie belangrijke routes gevolgd om de biologische functie van LRRK2 te bestuderen en om inzicht te verwerven in de achterliggende oorzaken van de pathobiologie van LRRK2. Deze routes zijn: de studie van de effecten van LRRK2 overexpressie in celcultuursystemen, het zoeken naar interactiepartners en substraten van LRRK2 en de karakterisatie van LRRK2 diermodellen. In deze thesis werden SHSY5Y neuroblastoma cellijnen aangemaakt met een stabiele overexpressie van de domeinen van LRRK2, LRRK2 fragmenten of het volledige proteïne, zowel wt als mutante vormen, door gebruik te maken van de ‘in-house’ lentivirale vector (LV) technologie. De viabiliteit van deze cellijnen werd grondig bestudeerd maar er werd in geen enkele cellijn celtoxiciteit vastgesteld. Deze resultaten stroken niet met initiële publicaties die een matige tot zeer uitgesproken celtoxiciteit rapporteerden na transiënte overexpressie van pathogene mutanten van LRRK2 en in mindere mate van wt LRRK2. Verschillende meer recente studies hebben echter ook geen nadelige effecten gerapporteerd van LRRK2 overexpressie op celviabiliteit. Bovendien werd er evenmin celdood waargenomen in LRRK2 transgene muizen. Op basis van al deze resultaten werden er in deze thesis verschillende secundaire effecten gedestilleerd, nl. de aard van de LRRK2 expressie constructen, het celtype, LRRK2 proteïne niveaus en de experimentele condities, die mogelijks aan de grondslag liggen van de huidige discrepantie betreffende de effecten van overexpressie van LRRK2 op celviabiliteit.
Tot slot werd er in deze thesis gestart met de zoektocht naar interactiepartners van LRRK2 in SHSY5Y neuroblastoma cellen om inzicht te krijgen in de cellulaire processen en signaaltransductiewegen waarin LRRK2 betrokken is. Een kandidaat interactiepartner van LRRK2 werd geïdentificeerd, nl. ErbB2. Aangezien dit proteïne in de literatuur reeds beschreven is in de context van signaaltransductiecascades, werd ErbB2 geselecteerd voor verder onderzoek. Momenteel wordt er gewerkt aan het valideren van ErbB2 als een functioneel belangrijke interactiepartner van LRRK2 in de context van PD.
Mutations in the leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene are the most common cause of familial Parkinson’s disease (PD). Moreover, the clinical and neuropathological manifestations of LRRK2-based PD are mostly indistinguishable from those observed in sporadic cases of the disease. Therefore, insight into the function of LRRK2 is very valuable in the study of the molecular pathogenesis of PD.
The LRRK2 gene encodes a complex ROCO protein encompassing several protein interaction motifs and a catalytic core region featuring two enzymatically active domains i.e. a Ras of Complex proteins (ROC) GTPase domain and a kinase domain, linked by the C-terminal of ROC (COR) domain. In this thesis, I studied the functional link between the inter- and intra-molecular organisation of LRRK2 and its GTPase activity. The resulting data provide mechanistic insight into the mode of action of the Y1699C LRRK2 mutant: the Y1699C substitution, situated at the intra-molecular ROC:COR interface, strengthens the intra-molecular ROC:COR interaction, thereby locally weakening the dimerization of LRRK2 at the ROC-COR tandem domain resulting in decreased GTPase activity. Based on these results, allosteric modulation of the intra-molecular ROC:COR interaction might provide a very specific targeting of LRRK2 activity as a novel approach in LRRK2 PD drug discovery.
To date, three major routes have been followed to study the biological function of LRRK2 and to unravel the causal events underlying LRRK2 pathobiology. These include the study of the effects of LRRK2 overexpression in cell culture models, the search for LRRK2 interaction partners and substrates and the characterisation of LRRK2 animal models. In this thesis, SHSY5Y neuroblastoma cell lines were generated, overexpressing single LRRK2 domains, fragments or the full-length protein, both wt and pathogenic mutants, using our in-house lentiviral vector (LV) technology. Viability of these cell lines was extensively studied, but no cellular toxicity was observed following overexpression of LRRK2 or LRRK2 fragments. These results are in contrast with initial reports showing mild to severe cytotoxicity after transient overexpression of LRRK2 pathogenic mutants and to a lesser extent also wt LRRK2. However, more recently several studies have reported an absence of adverse effects of LRRK2 overexpression on cell viability. Also LRRK2 transgenic mice do not present cell death. Based on all these results we have identified several secondary effects, including the nature of the LRRK2 expression construct, cell type, LRRK2 protein levels and the experimental setup, that may underlie the current discrepancy concerning the effects of LRRK2 overexpression on cell viability.
Finally, a search for LRRK2 interaction partners in SHSY5Y neuroblastoma cells was initiated to identify cellular processes and cell signalling pathways involving LRRK2. A candidate LRRK2 interactor was identified, i.e. ErbB2, with known properties as a cellular signalling protein which was selected for further study. Currently, work to validate ErbB2 as a functionally important interactor of LRRK2 in the context of PD is ongoing in the lab.