Gist en brood zijn onlosmakelijk met elkaar verbonden. De productie van CO2 om deeg te doen rijzen, wordt vaak gezien als de belangrijkste functie van gist. Tijdens het fermentatieproces zorgt gist echter ook voor de productie van componenten zoals ethanol, glycerol en organische zuren. Van deze fermentatiemetabolieten is geweten dat ze deegreologie, textuur, smaak en aroma van brood kunnen beïnvloeden. De mate waarin deze metabolieten geproduceerd worden tijdens de broodbereiding, is sterk afhankelijk van de ingrediënten (beschikbaarheid van nutriënten in bloem, aanwezigheid van zout,…), de fermentatietijd en –temperatuur, maar ook van de groeicondities en genetische achtergrond van de gebruikte giststammen.

Door het groeiende bewustzijn van de consument voor gezonde en gevarieerde voeding, worden industriële en artisanale bakkers continu uitgedaagd om bestaande eindproducten te verbeteren of broden met vernieuwde smaken of verbeterde nutritionele waarde te ontwikkelen. Hierbij kan de samenstelling van brood gewijzigd worden door, onder andere, toevoeging van enzymen als broodverbeteraars of zemel als bron van dieetvezel. Daarnaast kan ook ingespeeld worden op de gist die aangewend wordt voor broodbereiding. Hiervoor wordt typisch gebruik gemaakt van het species Saccharomyces cerevisiae. Dit species omvat echter tal van verschillende stammen die ook in andere industriële fermentatieprocessen toegepast worden, wat de broodindustrie tal van mogelijkheden biedt voor de wijziging van broodeigenschappen.

Voorafgaand aan dit doctoraatsonderzoek werd de impact van S. cerevisiae stammen, toegepast in verschillende industrieën, op deegreologie onderzocht. Hierbij kwam aan het licht dat sommige S. cerevisiae stammen tarwebloemdeeg slechts in heel beperkte mate konden doen rijzen. Deze observatie werd echter niet verder onderzocht en vormde de eerste doelstelling van deze doctoraatsstudie. Naast het inzicht verwerven in het inhibitiefenomeen door karakterisering en identificatie van de inhiberende tarwebloemfactor(en), werd als tweede doel ook de toepasbaarheid van verschillende (niet-bakkerij) stammen van S. cerevisiae voor de broodbereiding geëvalueerd.

In een eerste deel werd de fermentatiecapaciteit van 45 verschillende S. cerevisiae stammen, komende uit 5 verschillende industrieën (brood, bier, bio-ethanol, sake & spirits en wijn) nagegaan in verschillende fermentatiemedia. Na een eerste screening in vloeibaar medium, met dezelfde wateractiviteit als in deeg, bleken de geteste gisten een goed fermentatiepotentieel te vertonen, aangezien geen van de groepen – ondanks de individuele variatie – significant verschilde van de bakkerijstammen. In tarwebloem werd eveneens variatie tussen de individuele stammen waargenomen. Opmerkelijker was dat een vijfde van de giststammen een uiterst beperkte fermentatiecapaciteit vertoonde. Het totaalvolume CO2 dat geproduceerd werd na twee uur fermentatie lag tot 85% lager in vergelijking met de beste bakkersgist. De inhibitiegevoelige giststammen waren wel in staat om te fermenteren in een modeldeegsysteem bestaande uit gluten en zetmeel. Wanneer de waterige fase van het glutenzetmeeldeeg werd vervangen door een waterig tarwebloemextract, werd opnieuw hetzelfde inhibitiefenomeen als in tarwebloemdeeg waargenomen. Dit toonde aan dat de waterextraheerbare fractie van bloem een gistinhiberende component bevat.

In de volgende fase van het doctoraatsonderzoek werd dit inhibitiefenomeen verder gekarakteriseerd. Naast de fermentatiecapaciteit werd ook de groei van inhibitiegevoelige gisten beïnvloed door de inhibitor. Verschillende tarwevariëteiten en graansoorten werden getest en gelijkaardige inhibitie werd teruggevonden in alle tarwes, rogge, mais en gerst. Verder onderzoek toonde uiteindelijk aan dat de inhibitor een waterextraheerbaar tarwebloemproteïne was.

De inhibitor werd geïsoleerd door fractionering van een ruw tarwebloemextract waarbij de bekomen fracties telkens getest werden op inhibitie-activiteit. Hierbij werd achtereenvolgens gebruik gemaakt van kationuitwisselingschromatografie en reversed phase-HPLC. De proteïnen aanwezig in de zuiverste inhiberende fractie werden geïdentificeerd met behulp van LC-MS/MS en Edmandegradatie. Dit resulteerde in de assumptie dat de inhibitor het thaumatin-like proteïne was, wat bevestigd werd na het testen van de inhibitie-activiteit van een recombinant tot expressie gebracht thaumatin-like proteïne. De manier waarop het proteïne inwerkt op inhibitie-gevoelige gisten werd niet onderzocht in deze doctoraatsstudie, maar analogie met osmotine, een thaumatine-achtig proteïne uit tabak dat de permeabiliteit van de celwand beïnvloedt, werd gesuggereerd. Hoewel de inhibitie van bepaalde giststammen in een tarwebloembeslag in de jaren zeventig reeds werd toegeschreven aan purothionines, was dit niet in overeenstemming met onze resultaten. Enkele verschilpunten tussen ons onderzoek en de literatuur waren de extraheerbaarheid (petroleumether versus water), de grootte van de inhibitor (5 kDa versus ongeveer 24 kDa) en het verlies van inhibitie-activiteit in aanwezigheid van divalente ionen.

In het laatste deel van dit onderzoek werd de toepasbaarheid van een selectie van (niet-bakkers)gisten in de broodbereiding nagegaan. Uit de 45 stammen werden er 10 geselecteerd, inclusief twee inhibitie-gevoelige. Van deze kleine selectie werd vervolgens de metabolietproductie tijdens de fermentatie, de impact hiervan op deegreologie, alsook de invloed op broodaroma en andere kwaliteitsparameters nagegaan. Ondanks de variatie in de metabolietprofielen en het feit dat de invloed van individuele fermentatiemetabolieten op deegreologie reeds aangetoond werd in niet-gegiste degen, konden deze verschillen niet eenduidig gecorreleerd worden aan reologische veranderingen in gegiste degen. De voortdurende densiteitswijziging door de constante CO2-productie bleek mogelijke invloeden van metabolieten op de reologie te overstijgen. Analoog kon de variatie in fermentatiecapaciteit van de niet-geïnhibeerde gisten niet rechtstreeks gelinkt worden aan significante verschillen in broodvolume, kruimtextuur en kruimstructuur. Dit deed vermoeden dat de verschillen in fermentatie en metabolietproductie onvoldoende waren om tot uiting te komen in deeg- en broodkwaliteitsparameters. Bijgevolg resulteerde de aanwending van alle geselecteerde inhibitie-ongevoelige gisten in de productie van broden van gelijkaardige kwaliteit als dat van de bakkersgist. De productie van meer gewenste en/of minder ongewenste aromacomponenten zou de finale broodkwaliteit bijgevolg ten goede kunnen komen. Aangezien de aroma-analyses in dit onderzoek echter niet kwantitatief waren en bijgevolg slechts een indicatie gaven van het potentiële aromaprofiel, kon op dit vlak eveneens geen uitspraak gedaan worden over de voorkeur voor bepaalde niet-bakkerijgisten voor de broodbereiding.

Deze doctoraatsstudie gaf inzicht in het gist-specifieke inhibitiefenomeen, veroorzaakt door het thaumatin-like proteïne tijdens de fermentatie van tarwebloemdeeg. Deze bevindingen, samen met kennis over de concentratie van de inhibitor in tarwebloem en de manier waarop hij inwerkt op de verschillende gisten, kan de gist- en graangebaseerde fermentatie-industrieën zeker en vast ten goede komen. Modificatie van gisten om ze resistent te maken of van tarwe om de inhibitor te elimineren, kunnen oplossingen bieden om inhibitie-gevoelige gisten met een positieve impact op deeg en brood en die aangename aroma’s produceren, toch te kunnen aanwenden in de broodindustrie.

The production of tasty leavened bread is almost inseparably linked to the presence of Saccharomyces cerevisiae yeast. The main function of yeast during the fermentation phase is the production of CO2, resulting in dough leavening. Besides CO2, the yeast’s fermentation metabolism also results in the release of ethanol and other minor constituents, such as glycerol, organic acids and flavor components. These metabolites are known to have a major impact on dough rheology and bread texture, aroma and flavor. The amount and type of metabolites produced by yeast during bread making depend on the ingredients (nutrient availability in flour, salt, etc.), fermentation time and temperature as well as on the pregrowth conditions and genetic background of the yeast strain used.

As a consequence of the growing consumer’s interest in a wider variety of tasty and healthy food products, industrial and artisanal bakeries are challenged to improve end products. Strategies to do so include changing dough formulations by, for example, addition of enzymes as bread improvers or wheat bran as a source of dietary fiber. Also yeast technology can be used to change bread properties. The Saccharomyces cerevisiae species embraces a lot of different strains, applied in various industrial fermentation processes, offering a large potential for possible application in bread making.

Preliminary experiments in our lab showed a very limited fermentation ability of several S. cerevisiae strains in wheat flour dough while studying the impact of strains from diverse industrial categories on dough rheology. As this remarkable observation was left unexplored, the first aim of this doctoral research was to gain insight in this inhibition phenomenon by characterizing it and identifying the inhibition-causing factor(s). The second aim was to evaluate the applicability of (non-bakery) S. cerevisiae strains in bread making.

In a first part, the fermentation capacity of a set of 45 S. cerevisiae strains originating from 5 yeast-based industrial categories (bread, beer, bio‑ethanol, sake & spirits and wine) was screened in different fermentation media. In a liquid fermentation medium, with a water activity adjusted to the level in dough, no industrial category differed significantly from the category of bakery strains, suggesting that they all had good fermentation potential. In wheat flour dough, variation in fermentation capacity could be noticed amongst the yeast strains. Most remarkable was the very limited fermentation ability of one fifth of the yeast strains. They produced up to 85% less CO2 than the best bakery strain, clearly demonstrating fermentation inhibition in wheat flour dough. The inhibition-sensitive yeast strains performed significantly better in a gluten‑starch model dough. Replacing the aqueous phase of the model dough by a wheat flour extract induced the same degree of inhibition as did wheat flour dough, allowing to conclude that the water extractable fraction of wheat flour contains a yeast-inhibiting component.

In the next part of this PhD work, the yeast inhibition phenomenon was characterized. The representative of the inhibition-sensitive yeast strains showed an inhibited fermentation capacity in the presence of flour from different wheat varieties. Moreover, rye, maize and barley had a similar effect on the yeast’s fermentation ability. After further analyses, the inhibition-causing factor turned out to be a water extractable wheat flour protein. Starting from a crude wheat flour extract, the inhibitor was isolated by activity-guided fractionation with cation exchange chromatography and reversed phase-HPLC. Identification of the proteins present in the purest inhibition-active fraction with LC/MS-MS and Edman degradation pointed towards the thaumatin-like protein as the inhibition causing factor. This finding was validated by the fact that the recombinantly expressed target protein also showed fermentation inhibition in representative of the sensitive yeast strains. Based on the differences in sensitivity of S. cerevisiae strains towards the inhibitor, a mode of action comparable with that of thaumatin-like tobacco osmotin was suggested, mainly affecting the permeability of the yeast cell wall. Although the inability of brewer’s yeasts to ferment a wheat flour batter was in the early seventies ascribed to purothionins, this was not conform to our results.

In the last part, the applicability of a selection of (non-bakery) S. cerevisiae strains in the bread making process was evaluated. After screening 45 yeast strains for their metabolite and aroma profiles, 10 strains (two from each industrial category), including two inhibition-sensitive strains, were selected for further examination of their impact on dough rheology and their influence on final bread aroma and quality characteristics. As was expected based on the variability in fermentation properties, metabolite analysis of these strains during fermentation also showed different profiles. In spite of these differences and of the fact that individual fermentation metabolites have already been shown to impact rheology in yeastless dough, no clear correlations were found between metabolites produced and rheological changes in yeasted dough. The constant change in density through CO2 production was assumed to have the foremost impact on dough properties. Similarly, significantly differing fermentation capacities did not necessarily result in significantly different bread volumes. Furthermore, no clear differences in crumb texture and structure between a control bakery strain and the other inhibition-insensitive yeast strains were observed. The determined variation in fermentation capacity and metabolite production between yeast strains did not seem sufficiently outspoken to result in significant differences in bread volume and texture. All inhibition-insensitive strains in the selection gave rise to breads with similar characteristics to those obtained with the control bakery strain. Aroma profile analysis hinted towards more significant differences between the different strains.

The research in this PhD study gave insight in a yeast specific inhibition phenomenon, caused by the thaumatin-like protein during wheat flour dough fermentation. This finding is of clear interest for yeast- and cereal-based fermentation industries, although further work is required on inhibitor quantification and its mode of action. The improvement of existing strains by breeding, the creation of new strains through genetic modification, or genetic modification of wheat to eliminate the harmful component might provide some solutions to enable yeast strains with a beneficial impact on dough and bread quality parameters or with a pleasant volatile compound profile, to be used in the bakery industry.