Pectine is een celwandpolysacharide dat voornamelijk geëxtraheerd wordt uit de afvalstromen van de citrus- en appelverwerkende industrie en vaak gebruikt wordt als additief in onder andere groenten- en fruitgebaseerde levensmiddelen. De voornaamste toepassing is als gelerend agens omwille van zijn capaciteit om tweewaardige kationen te binden, zoals Ca2+. Deze functionaliteit van pectine wordt grotendeels beïnvloed door zijn structurele eigenschappen, in het bijzonder door de graad van methylverestering (degree of methylesterification, DM) en graad van bloksgewijsheid (absolute degree of blockiness, DBabs). De relatie tussen deze structuureigenschappen van pectine en de Ca2+ binding of gelering werden reeds uitgebreid bestudeerd. Desalniettemin ontbreekt tot op heden een fundamenteel inzicht in de interactie tussen pectine en Ca2+. Bovendien is zeer weinig informatie beschikbaar over hoe de structuureigenschappen van pectine de binding met andere tweewaardige kationen beïnvloeden, zoals Fe2+ of Zn2+. Nochtans bestaat de hypothese dat de binding van dergelijke kationen aan pectine kan leiden tot andere specifieke functionaliteiten. Zo kan bijvoorbeeld de binding van essentiële divalente kationen (zoals Zn2+) aan pectine leiden tot een verlaagde biotoegankelijkheid tijdens de vertering, wat mogelijk resulteert in mineraal deficiënties. Pectine is immers een dieetvezel die niet wordt afgebroken tijdens de vertering in de dunne darm. Daarnaast wordt verondersteld dat de binding van Fe2+ aan pectine kan resulteren in een vertraging van de lipide oxidatie in emulsie-gebaseerde levensmiddelen en dus bijdraagt tot het antioxiderend vermogen van pectine. Op die manier zou pectine kunnen fungeren als natuurlijk antioxidant en zo het gebruik van artificiële antioxidanten zoals ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) mogelijk reduceren, wat interessanter geacht wordt voor de consument. Bijgevolg is het doel van dit doctoraat om fundamenteel inzicht te verwerven in het effect van de DM en DBabs van pectine op de interactie met Fe2+, Zn2+ of Ca2+ en de geassocieerde functionaliteiten, in het bijzonder het antioxiderend vermogen en de rol in de Zn2+ biotoegankelijkheid.

Pectinestalen met vergelijkbare graad van methylverestering (DM) maar verschillende patronen (DBabs) werden aangemaakt via enzymatische (gebruik makend van wortel pectine methylesterase) of basische (met NaOH) demethylesterificatie startend van hoog-methylveresterd citruspectine. In eerste instantie werd de interactie van deze pectinestalen met Fe2+, Zn2+ of Ca2+ bestudeerd via evenwichts-adsorptie experimenten. Dit resulteerde in adsorptie-isothermen die werden gemodelleerd op basis van het Langmuir adsorptie-isotherm model ter kwantificatie van de maximale bindingscapaciteit en gerelateerde interactie-energie. De resultaten van deze studie toonden aan dat pectine met afnemende DM of toenemende DBabs meer Fe2+, Zn2+ of Ca2+ kon binden. De maximale bindingscapaciteit was bovendien voornamelijk beïnvloed door de DM, terwijl de interactie-energie eerder door de DBabs bepaald werd. De pectinestalen vertoonden de hoogste bindingscapaciteit en interactie-energie voor Zn2+, gevolgd door Ca2+ en Fe2+. Daarnaast werden ook de thermodynamische eigenschappen van de pectine-kation interacties, in het bijzonder de pectine-Zn2+ binding, bestudeerd door isotherme titratie calorimetrie (ITC). Deze resultaten vormden een aanvulling op deze van de evenwichts-adsorptie experimenten. ITC toonde immers aan dat de Zn2+ binding aan pectine een endotherme reactie is, waarbij een positieve entropieverandering de ongunstige endothermische enthalpieverandering domineerde. De pectine-Zn2+ interactie verloopt daarnaast via een twee-stap mechanisme met eerst monocomplexatie en de vorming van point-like cross-links, gevolgd door dimerizatie.

Vervolgens werd bestudeerd in welke mate de DM en DBabs van pectine en de gerelateerde interactie met Zn2+ invloed hadden op de Zn2+ biotoegankelijkheid. Dit werd verwezenlijkt door het uitvoeren van een in vitro gesimuleerde vertering van pectineoplossingen die werden aangereikt met Zn2+. Een afnemende DM of toenemende DBabs resulteerde in een dalende Zn2+ biotoegankelijkheid, wat te wijten is aan een grotere bindingscapaciteit van pectine. Desalniettemin bleken kleinere hoeveelheden Zn2+ biotoegankelijk te zijn dan verwacht kon worden op basis van de eerder vastgestelde maximale Zn2+-bindingscapaciteit van pectine. Dit wijst op mogelijke binding van Zn2+ aan galzouten of enzymen die tijdens de in vitro gesimuleerde vertering werden toegevoegd. Daarnaast werd de mogelijk competitie tussen Ca2+ en Zn2+ voor binding aan pectine tijdens de digestie onderzocht en een lage concentratie Ca2+ (ongeveer 0.33 mM) had geen duidelijk effect op de Zn2+ biotoegankelijkheid.

Met het oog op het gebruik van natuurlijke antioxidanten ter reductie van synthetische, werd tot slot het antioxiderend vermogen van de pectinestalen bestudeerd in lijnzaad/zonnebloem olie-in-water (o/w) emulsies (5% w/v), die werden aangereikt met Fe2+. Het peroxidegetal werd bepaald in functie van de bewaartijd. Laag DM pectine en een verhoogde pectine concentratie hadden een positief effect op het antioxiderend vermogen omwille van een verhoogde Fe2+ bindingscapaciteit. Het antioxiderend vermogen van pectine was echter lager dan dit van EDTA. Bovendien destabiliseerde pectine de o/w emulsie door flocculatie (bridging of depletion flocculation). 

Extracted pectin is currently widely used as a food additive in plant-based products, particularly in gelling applications, due to its ability to bind divalent cations, especially Ca2+. This pectin functionality has been reported to be largely influenced by its structural properties, in particular the degree and pattern of methylesterification (DM) and blockiness (DBabs), which are a measure for the percentage and distribution of non-methylesterified galacturonic acid units, respectively. Although the role of these structural properties in Ca2+-binding and gelling has been widely explored, fundamental insights into these interactions are limited. Moreover, scarce information is available on the role of the pectin properties in the interaction with other divalent cations, despite the hypothesized ability of pectin to bind these divalent cations yielding specific functionalities. For instance, given that pectin is a dietary fiber and thus not digestible in the small intestine, its interaction with essential divalent cations, such as Zn2+, could result in reduced mineral bioaccessibilities during digestion, potentially contributing to mineral deficiencies. Additionally, binding of Fe2+ has been considered to confer pectin a lipid antioxidant capacity in emulsion-based products, thereby retarding lipid oxidation. Exploring this pectin functionality could promote its use as a natural antioxidant which is more appealing to consumers compared to synthetic additives, such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Therefore, this doctoral thesis aimed to provide fundamental insights into the effect of pectin DM and DBabs on its interaction with Fe2+, Zn2+, or Ca2+ and associated functionalities, particularly the lipid antioxidant capacity and its role in the Zn2+ in vitro bioaccessibility.

Pectin samples with comparable methylesterification degrees (DM) but different patterns of methylester distribution (DBabs) were generated through enzymatic (using carrot pectin methylesterase) or alkaline (using NaOH) demethylesterification of high methylesterified citrus pectin. First, the interaction of these pectin samples with Fe2+, Zn2+, or Ca2+ was explored through equilibrium adsorption experiments, followed by generation of adsorption isotherms based on the Langmuir adsorption isotherm model to quantify their maximum binding capacities and associated interaction energies. Results of this study showed that decreasing pectin DM or increasing DBabs promoted the Fe2+-, Zn2+-, or Ca2+-binding capacity of pectin, with the maximum binding capacity being mainly determined by the DM and the interaction energy by DBabs. With regard to cation type, the highest maximum binding capacity and interaction energy were exhibited for Zn2+ compared to Ca2+ and Fe2+. Additionally, insights into the thermodynamics of the pectin-cation interaction, particularly pectin-Zn2+ binding, were obtained using isothermal titration calorimetry (ITC). Results obtained complemented those from the equilibrium adsorption experiment. The binding of Zn2+ to pectin was found to be an endothermic interaction, in which a positive entropy change dominated the unfavorable endothermic enthalpy change. Moreover, the pectin-Zn2+ interaction occurred according to a two-step mechanism involving first monocomplexation and the formation of point-like cross-links, followed by dimerization.

The role of pectin DM and DBabs, and associated pectin-Zn2+ interaction, in directing Zn2+ bioaccessibility was subsequently studied through in vitro simulated digestion of Zn2+-enriched pectin solutions. Decreasing DM or increasing DBabs resulted in decreased Zn2+ bioaccessibilities due to higher Zn2+-binding capacities. However, lower amounts of Zn2+ than expected (based on the established maximum Zn2+-binding capacity of pectin) were bioaccessible, suggesting binding of Zn2+ to the bile salts and probably enzymes added during the in vitro simulated digestion. Exploration of the possible competition between Ca2+ and Zn2+ for binding to pectin during digestion revealed that low Ca2+ levels (approximately 0.33 mM) had no clear influence on Zn2+ bioaccessibility.

In view of identifying (potential) natural antioxidants to reduce synthetic ones, the lipid antioxidant capacity of the derived pectins in Fe2+-enriched linseed/sunflower oil-in-water (o/w) emulsions (5% w/v) was explored by determination of the peroxide value as a function of storage time. Low DM pectin and increased pectin concentration promoted the lipid antioxidant capacity, due to an increased Fe2+-binding capacity. However, EDTA exhibited still a higher antioxidant capacity compared to low DM pectin. Moreover, pectin was found to destabilize the o/w emulsions by bridging or depletion flocculation.

This doctoral thesis clearly demonstrated the role of DM and DBabs in directing pectin cation-binding capacity and associated functionalities. The results obtained provide fundamental insights into the pectin structure-function relation which in turn can contribute to optimization of ex situ pectin functionalities in several applications, including product structure build-up while maintaining the nutritional value of the food product. Moreover, these findings form a basis for potential exploitation of pectin as an antioxidant as well as exploring pectin functionalities in situ