Het overmatig en foutief inzetten van antibiotica heeft de evolutie van antibioticumresistentie sterk aangewakkerd, waardoor succesvol antibioticumgebruik in de gezondheidszorg bedreigd wordt. Indien er geen doeltreffende maatregelen genomen worden, zullen we spoedig terugkeren naar het pre-antibioticum tijdperk waarin zelfs banale infecties dodelijk waren. Daarom is het van levensbelang om de mechanismen die resistentie-ontwikkeling beïnvloeden, te begrijpen, zodat deze kennis ingezet kan worden in de ontwikkeling van alternatieve, meer duurzame behandelingsstrategieën die minder gevoelig zijn aan resistentie-ontwikkeling of de levensduur van de huidige antibiotica kunnen verlengen. Daarom is het doel van dit doctoraat om de kennis rond de ontwikkeling van antibioticumresistentie ten opzichte van deze alternatieve behandelingsstrategieën te vergroten.

In een eerste deel van dit doctoraat werden de factoren onderzocht die een invloed hebben op het cyclisch toedienen van antibiotica. Dit blijkt een veelbelovende strategie die wordt voorgesteld om de levensduur van onze huidige antibiotica te verlengen. Deze strategie is voornamelijk gebaseerd op het concept van collaterale gevoeligheid, waarbij resistentie tegen een eerste antibioticum de gevoeligheid verhoogt tegen een tweede antibioticum. De verhoogde gevoeligheid ten aanzien van het tweede antibioticum, als gevolg van resistentie-ontwikkeling tegen het eerste antibioticum, zal vervolgens de verspreiding van resistentie beperken. In dit werk toonden we aan dat naast de effecten van collaterale gevoeligheid, de verminderde evolutie van resistentie na blootstelling aan een tweede antibioticum ook beïnvloed wordt door interacties tussen mutaties geaccumuleerd tijdens de blootstelling aan het eerste antibioticum en mutaties noodzakelijk om resistentie te verwerven tegen het tweede antibioticum. Bovendien had het blootstellingspatroon van het eerste antibioticum ook een invloed op de adaptatie aan het tweede antibioticum. Bacteriën blootgesteld aan een gradueel toenemende antibioticumgradiënt vertoonden meer adaptatie aan het tweede antibioticum in vergelijking met bacteriën die aan een zeer sterke concentratiegradiënt werden blootgesteld. Deze verhoogde adaptatie kan mogelijks te wijten zijn aan de associatie van zwakkere antibioticumgradiënten met hogere niveaus van klonale interferentie in resistentie-geassocieerde genen en lagere resistentiekosten. Deze resultaten tonen aan dat naast aspecten van collaterale gevoeligheid zowel de interacties tussen resistentiemutaties en hun aanpassingsvermogen ten opzichte van een tweede antibioticum als het blootstellingspatroon van antibiotica in rekening gebracht moeten worden bij het succesvol cyclisch toedienen van antibiotica.

In het tweede deel van dit werk werden de beschermende effecten van publieke β-lactamasen ten opzichte van gevoelige cellen bepaald. Afhankelijk van de condities bieden β-lactamasen niet alleen bescherming aan de producerende cellen, maar ook aan gevoelige cellen in hun nabije omgeving. Deze gedeelde bescherming zou uiteindelijk kunnen resulteren in de exploitatie en mogelijks zelfs het wegconcurreren van de resistente cellen, aangezien susceptibele cellen alle voordelen (d.w.z. bescherming) krijgen tijdens de antibioticumbehandeling zonder energie te investeren in de productie van het gedeelde resistentiemechanisme. Meerdere studies vermelden reeds de beschermende effecten onder een brede waaier aan parameters, maar de schaal waarop één β-lactamase-producerende cel bescherming biedt aan de gevoelige cellen in zijn nabijheid is tot op heden nog niet bepaald. Een breder begrip van al deze factoren die de selectie van resistentie beïnvloeden, kan eventueel nieuwe mogelijkheden bieden voor alternatieve therapieën die de verspreiding van resistentie beperken. We bevestigden eerst de gedeelde aspecten van β-lactamasen in Salmonella-biofilmen onder verschillende parameters (bijv. de antibioticumconcentratie, het celaantal en de frequentie van de produceerders) voordat we het beschermingsbereik op het niveau van één cel bepalen met behulp van time-lapse confocale microscopie. Het beschermende effect van β-lactamasen vertoonde een sterke negatieve-frequentie-afhankelijke selectie die toeneemt met de antibioticumconcentratie en omgekeerd evenredig is met het aantal cellen op populatieniveau. Bovendien konden geen lokale beschermingseffecten van de β-lactamasen waargenomen worden, wat suggereert dat de β-lactamasen alomtegenwoordig zijn in het batch-systeem waarin de biofilmen gevormd werden. Dit sluit echter niet uit dat effecten van lokaliteit toch belangrijk zouden kunnen zijn in andere systemen, zoals in een flow cell model, waarin β-lactamasen constant verwijderd worden. Ondanks de sterke selectie voor resistentie bij hoge antibioticumconcentraties, werd deze selectie sterk verlaagd in afwezigheid van antibiotica of bij zeer lage antibioticumconcentraties. Algemeen genomen zal de tegenselectie van β-lactamasen maar in beperkte mate mogelijk zijn omwille van de privé-aspecten en de lage kost geassocieerd met β-lactamasen. Echter, dit zou voldoende moeten zijn om de transmissie van resistentie naar de omgeving te verhinderen in vergelijking met privé-resistentiemechanismen.

Ten slotte, aangezien de lokale effecten van β-lactamasen verhoogd zou kunnen worden door het gebruik van flow cells, zou het interessant zijn om de verspreiding van resistentie met hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen. Bovendien kan de productie van β-lactamasen ook op een specifiek tijdstip worden geïnduceerd om zo lokale effecten te maximaliseren. Om resistentie op spatiotemporele schaal te bestuderen, werd een induceerbaar lichtgevoelig resistentieconstruct geconstrueerd. In dit doctoraat, werd dit genetisch construct geoptimaliseerd om de basale expressie tot een minimum te reduceren en werd bevestigd dat resistentie kan geïnduceerd worden na blootstelling aan licht. In de toekomst zal deze tool niet enkel helpen om de verspreiding en/of lokale effecten van β-lactamresistentie te bestuderen, maar kan deze ook ingezet worden met andere resistentiemechanismen. Bijgevolg zal dit lichtgevoelig construct meer informatie aanleveren omtrent de factoren die resistentieverspreiding beïnvloeden.

Samenvattend draagt dit doctoraatsonderzoek bij tot een beter begrip van de onderliggende factoren die de evolutie van resistentie beïnvloeden ten aanzien van alternatieve antimicrobiële behandelingen, met een focus op het cyclisch toedienen van antibiotica en de exploitatie van publieke resistentiemechanismen. Bovendien worden nieuwe tools aangereikt om resistentie met een verhoogde precisie te bestuderen.

The exacerbated and incorrect use of antibiotics has fueled the evolution of antibiotic resistant strains, endangering the successful administration of antibiotics in healthcare. If no appropriate measures are taken, reports estimate that we will soon return to the pre-antibiotic era in which even banal infections can be lethal. In order to prevent this to happen, it is of vital importance to grasp the underlying mechanisms responsible for resistance evolution in order to develop alternative and more sustainable treatment strategies that are less prone to resistance evolution or prolong the use of the current antibiotic portfolio. Therefore, this PhD thesis aims to increase the understanding of resistance development against these alternative strategies.

In a first part of the PhD, the factors influencing antibiotic cycling, a promising strategy proposed to increase the lifetime of our currently prescribed antibiotics, were examined. To date the informed cycling between antibiotic pairs is only based on the concepts of collateral sensitivity, where resistance to a first antibiotic increases the susceptibility to a second. Consequently, the increased susceptibility to the second antibiotic due to resistance evolution to the first antibiotic prevents the spread of resistance. Here, we showed that decreased resistance evolution upon exposure to a second antibiotic is not solely dependent on the collateral sensitivity effect, but is also impacted by interactions between mutations accumulated during repeated exposure to the first antibiotic and mutations required to develop resistance against a second antibiotic. Furthermore, the way the first antibiotic was administered had an impact on how bacteria adapted to subsequent antibiotics. Bacteria that were exposed to a gradual increase in antibiotic concentration showed greater adaptation to certain second antibiotics, compared to bacteria exposed to steep concentration gradients. This enhanced adaption potential may be attributed to weaker gradients being associated with higher levels of clonal interference in resistance-associated genes and a reduced cost of resistance. Altogether, our results indicate that for the successful implementation of antibiotic cycling strategies, not only collateral sensitivity but also interactions between resistance mutations and their adaptative potential to second antibiotics as well as their impact on the antibiotic exposure patterns should be taken into account.

In the second part, the protective effects of public β-lactamases toward susceptible cells were determined. Depending on the conditions, β-lactamase producing strains not only protect themselves from antibiotic treatment but also sensitive cells in their close proximity. This shared protection might eventually result in the exploitation and even outcompetition of resistant strains, as susceptible cells receive the benefits (i.e. protection) upon antibiotic treatment, without spending energy to the production of the resistance mechanism. While multiple reports already support these protective effects to susceptible cells under a wide variety of conditions, the spatial range at which a single β-lactamase producing cell offers protection to its susceptible counterparts has not yet been determined. Increasing the knowledge on the factors that influence the selection of resistance will hopefully provide novel avenues towards alternative treatments with the potential to limit the selection for resistance. We first confirmed the shared aspects of β‑lactamases in Salmonella biofilms under a variety of conditions (e.g. antibiotic treatment concentration, cell number and strain frequency) before measuring the protective range at the single cell level by means of time-lapse confocal microscopy. The protective effect showed strong negative-frequency dependent selection, which increases with antibiotic concentration and is inversely related with the cell number at the population level. However, we did not find any local protective effects of the shared β-lactamases suggesting that the β-lactamases were ubiquitously present in the batch system in which the biofilms were cultured. However, this does not exclude that effects of locality might still be important in other systems, such as in a flow cell model, where β-lactamases are constantly removed. Despite the strong selection for resistance observed at high antibiotic concentrations, selection for resistance was reduced in absence of antibiotic treatment or if low antibiotic concentrations were applied. Overall, counterselection of β‑lactamases will only be achieved to a certain extent due to the private aspects and the low costs associated with β-lactamases. This might however suffice to reduce the transmission of resistance to the environment compared to private resistance mechanisms.

Finally, as the implementation of flow cells could potentially increase local protective effects of β‑lactamases, it would be beneficial to study the spread of resistance at high spatiotemporal resolution. Additionally, β-lactamase production can also be induced at a specific timepoint to maximize effects of locality. To study resistance at spatiotemporal resolution, a light-sensitive resistance construct was genetically engineered. Hereto, we optimized the construct to reduce the basal expression and confirmed that upon light exposure resistance is induced. This tool will not only assist to study the spread and/or local effects of β-lactam resistance at high spatial resolution, but can also be broadly applied with other resistance mechanisms. Consequently, this light-sensitive construct will provide deeper understanding of factors that influence resistance evolution.

In conclusion, this PhD research contributes to the increased understanding of the underlying factors influencing resistance evolution against alternative antimicrobial treatments, focusing on antibiotic cycling and the exploitation of public resistance mechanisms, and provides new tools to study antibiotic resistance development at an unprecedented spatiotemporal resolution.