De snelle toename van antibioticaresistentie brengt ons vermogen in gevaar om bacteriële infecties op efficiënte wijze onder controle te krijgen. Er is een dringende nood aan alternatieve behandelingen om het gebruik van antibiotica te vervangen of te complementeren. Probiotica staan daarbij toenemend in de belangstelling, met name vanwege hun veelzijdige mechanismen om pathogenen te bestrijden. Ondanks hun potentieel en lange gebruiksgeschiedenis, is de manier waarop ze in competitie treden met pathogenen vaak niet goed gekarakteriseerd. Daarom is het begrijpen van deze interacties van cruciaal belang om de behandeling met probiotica te optimaliseren. Gezien het toenemende gebruik van probiotica als alternatieve behandeling om antibioticaresistente pathogenen te bestrijden, is het belangrijk om hun werkzaamheid te bepalen tegen pathogenen die voordien resistentie ontwikkelden tegen klinisch gebruikte antibiotica. We stelden de hypothese dat antibioticaresistentiemechanismen de werkzaamheid van probiotica kunnen beïnvloeden, en onderzochten daarom de precieze wisselwerking tussen probiotica en antibioticaresistentie pathogenen. Met behulp van een reeks in vitro testen onderzochten we of specifieke interacties strategische voordelen kunnen bieden in de strijd tegen antibioticaresistentie.

In het eerste deel van dit onderzoek bekeken we of combinatorische behandeling met probiotica en antibiotica een veelbelovende strategie kan zijn indien de pathogeen een publiek resistentiemechanisme draagt. De productie van antibiotica-modificerende enzymen, zoals β-lactamasen, is een gekend voorbeeld van een publiek resistentiemechanisme dat kan voorkomen bij pathogenen. Het wordt publiek genoemd omdat het niet alleen resistentie biedt aan de producerende pathogene cellen, maar bij uitbreiding ook omliggende gevoelige cellen beschermt tegen het antibioticum dat wordt afgebroken door de enzymatische activiteit. We onderzochten of deze antibiotica-modificerende enzymen in ons voordeel zouden kunnen werken, omdat ze bescherming bieden aan de gevoelige probiotische cellen in combinatiebehandeling met het antibioticum, waardoor het probioticum de pathogeen kan inhiberen wanneer het antibioticum op zichzelf daartoe niet in staat is. Hiertoe voerden we competitie-experimenten uit tussen β-lactamase-producerende Salmonella Typhimurium en het gevoelige probioticum Escherichia coli Nissle tijdens behandeling met het antibioticum cefotaxime. We varieerden factoren waarvan voorspeld werd dat ze de bescherming van het probioticum zouden beïnvloeden, zoals antibioticumdosis, tijdstip van behandeling en inoculumdichtheid/-verhouding. We tonen aan dat bescherming van het gevoelige probioticum optreedt onder veel van de geteste condities. Berscherming werd ook waargenomen bij een andere stam die Salmonella inhibeert, nl. Bacillus subtilis PS216, wat de algemene geldigheid van onze bevindingen onderstreept. Bovendien vinden we dat inhibitie door het probioticum gecorreleerd is met de graad van bescherming dat Salmonella tegen het antibioticum biedt. In de huidige klinische praktijk zijn combinatorische behandelingsopties beperkt vanwege het afsterven van het probioticum door het antibioticum. Ons werk benadrukt het toekomstige potentieel van combinatorische behandeling als een risicospreidende strategie om pathogenen te bestrijden die mogelijks drager zijn van een coöperatief resistentiemechanisme.

In het tweede deel van dit onderzoek bestudeerden we of resistentie tegen klinische antibiotica de gevoeligheid voor bepaalde probiotica kan verhogen (= collaterale sensitiviteit) of verlagen (= kruisresistentie). Hiervoor werd eerst een high-throughput flow cytometrie-gebaseerd experiment geoptimaliseerd welke de groei en efficiënte telling van een groot aantal coculturen toelaat bestaande uit Salmonella en probiotica. Hiertoe werd een geschikt groeimedium geselecteerd en werd gezocht naar een genomisch geïntegreerd fluorescent proteïne waarvan het fluorescentiesignaal intens genoeg is om Salmonella en probiotic van elkaar te kunnen onderscheiden met behulp van flowcytometrie. Vervolgens werd het geoptimaliseerde flow cytometrie experiment gebruikt om een breed scala aan antibioticaresistente Salmonellae in competitie te plaatsen met acht probiotische stammen. Hierbij zochten we naar combinaties die veranderingen vertoonden in de fitness van Salmonella ten opzichte van antibioticagevoelige Salmonella, omdat dit zou kunnen duiden op collaterale sensitiviteit of kruisresistentie tegen het probioticum. De antibioticaresistente stammen zijn afkomstig van experimentele evolutie met antibiotica of zijn plasmide-gecodeerd. Binnen onze dataset werden geen sterke aanwijzingen gevonden voor kruisresistentie, terwijl er veel gevallen van collaterale sensitiviteit voorkwamen. De aanwezigheid van bepaalde resistentiemechanismen verlaagt de fitness van Salmonella aanzienlijk in competitie met bepaalde probiotica, en leidt in sommige gevallen tot een snellere afname van Salmonella wanneer deze meerdere dagen in competitie gezet werd met probiotica. Bovendien bleek een afwijkende groei van Salmonella als gevolg van de evolutie met antibiotica niet gecorreleerd met een verminderde fitness in competitie met probiotica. Deze bevindingen suggereren dat specifieke resistentiemechanismen de gevoeligheid voor probiotica rechtstreeks beïnvloeden. De analyse van de genoomsequenties laat een lage mutatielast zien voor de meeste stammen en maakte het mogelijk om voorlopige hypotheses te formuleren over onderliggende mechanismen, welke verder onderzocht kunnen worden in toekomstig werk.

Onze onderzoeksinspanningen benadrukken het potentieel van probiotica om antibioticaresistente pathogenen te bestrijden, aangezien twee verschillende scenario's werden onderzocht waarin de potentiële voordelen werden aangetoond van het gebruik van probiotica als een alternatieve of complementerende behandeling voor antibiotica. Een beter begrip van de onderliggende mechanismen is echter noodzakelijk om de rationele selectie van probiotische stammen te verbeteren met als doel om hun werkzaamheid tegen antibioticaresistente pathogenen te optimaliseren. Daarnaast zal de overgang naar in vivo experimenten van groot belang zijn om de klinische relevantie van onze bevindingen te beoordelen en deze te vertalen naar concrete probiotische behandelingsschema's in de toekomst.

The rapid rise of antibiotic resistance is compromising our ability to effectively control bacterial infections. There is a pressing need for alternative treatments to substitute or complement the use of antibiotics. Probiotics are increasingly attracting attention in this regard, particularly due to their multifaceted modes of action to combat pathogens. Despite their promising potential and long history of use, the exact ways in which they compete with pathogens are however not well characterized. Therefore, understanding these interactions will be pivotal to optimize probiotic treatment in the future. In light of the rising use of probiotics as an alternative treatment to combat antibiotic-resistant pathogens, it will become crucial to assess their efficacy against pathogens that previously developed resistance to clinically employed antibiotics. We hypothesized that antibiotic resistance mechanisms can affect probiotic efficacy, and therefore sought to examine the exact interplay between probiotics and antibiotic-resistant pathogens. By use of a series of in vitro assays we investigated whether specific interactions can confer strategic advantages in the context of combating antibiotic resistance.

In the first part of this research, we examined whether combinatorial treatment with probiotics and antibiotics can serve as a promising strategy in case the pathogen carries a public resistance mechanism. The production of antibiotic-modifying enzymes, such as β-lactamases, is a prime example of a public resistance mechanism that can occur in pathogens. It is termed public because it not only provides resistance to the producing pathogenic cells, but in extension also protects surrounding susceptible cells from the antibiotic that gets broken down by the enzymatic activity. We investigated whether these antibiotic-modifying enzymes could serve to our advantage, as they provide protection to the susceptible probiotic cells in cotreatment with the antibiotic, in this way possibly potentiating the probiotic to inhibit the pathogen when the antibiotic alone is not able to. Hereto, we performed competition experiments between β-lactamase-producing Salmonella Typhimurium and the susceptible probiotic Escherichia coli Nissle during treatment with the antibiotic cefotaxime. We varied factors that were predicted to influence protection of the probiotic, like antibiotic dose, timing of treatment and inoculum density/proportion. We present evidence that protection of the susceptible probiotic occurs under many of the tested conditions. Protection was also observed for another strain that inhibits Salmonella, i.e. Bacillus subtilis PS216, indicating the genericity of our findings. Additionally, we found that protection of, and inhibition by the probiotic are correlated, indicating that protection of the probiotic potentiates its inhibitory actions against the pathogen. In current clinical practice, combinatorial treatment options are limited due to killing of the probiotic by the antibiotic. Our work highlights the future potential of applying combinatorial treatment as a risk-spreading strategy to combat pathogens that potentially carry a public resistance mechanism.

In the second part of this research, we studied whether resistance against clinical antibiotics in pathogens can increase (= collateral sensitivity) or decrease (= cross-resistance) susceptibility to probiotics. To this end, a high-throughput flow cytometry-based assay was first optimized to allow the growth and rapid enumeration of a large number of cocultures containing Salmonella and probiotics. To achieve this, a suitable growth medium was selected, and a search was conducted for a genomically integrated fluorescent protein that is bright enough in its fluorescent signal to allow distinction between Salmonella and probiotics using flow cytometry. Next, the optimized flow cytometry assay was employed to compete a wide range of antibiotic-resistant Salmonellae with eight probiotic strains. We hereby searched for combinations that display alterations in the fitness of Salmonella compared to the wild-type, as this could indicate collateral sensitivity or cross-resistance against the probiotic. The antibiotic-resistant strains either originated from experimental evolution with antibiotics or were plasmid-encoded. Within our dataset, no strong indications for cross-resistance were found, whereas collateral sensitivity events were abundant. The carriage of certain resistance mechanisms substantially lowered Salmonella’s fitness in competition with specific probiotics, and in some cases led to faster outcompetition when challenged with probiotics for multiple days. Moreover, aberrant growth of Salmonella resulting from evolution with antibiotics was found not to be correlated to a reduced fitness in competition with probiotics. These findings suggest that specific resistance mechanisms directly influence probiotic susceptibility. Whole genome sequencing analysis revealed an overall low mutation load for most strains and allowed the formulation of preliminary hypotheses on underlying mechanisms that could guide further work.

Our research endeavors highlight the potential of probiotic employment to combat antibiotic-resistant pathogens, as two distinct scenarios were explored in which the potential benefits of utilizing probiotics were demonstrated as an alternative or complementary treatment to antibiotics. However, a deeper understanding of the underlying mechanisms will be imperative to improve the rational selection of probiotic strains to enhance their efficacy against antibiotic-resistant pathogens. Additionally, the transition to in vivo experiments will be of paramount importance to assess the clinical relevance of our findings and to translate them to tangible probiotic treatment regimens in the future.